Pdcd-1 Particelle di Attivazione Lentivirale (h2): sc-403008-LAC-2

Il gene umano PDCD1 codifica per il recettore inibitorio del checkpoint immunitario PD-1 (Pdcd-1), una proteina di membrana di tipo I espressa su linfociti T e B attivati e su sottopopolazioni di cellule mieloidi, che limita la segnalazione dei recettori per l’antigene al fine di mantenere la tolleranza periferica. Dopo il legame con PD-L1 o PD-L2, PD-1 recluta la fosfatasi SHP2 tramite i suoi motivi ITIM/ITSM per attenuare la segnalazione prossimale di TCR/CD28, riducendo l’attività delle vie PI3K–AKT e RAS–MAPK e rimodellando programmi trascrizionali legati alla funzione effettrice, al metabolismo e all’esaurimento. Un’espressione o una segnalazione deregolata di PDCD1 è associata a infezioni croniche e a disfunzioni immunitarie correlate ai tumori, oltre che all’autoimmunità, a testimonianza del suo ruolo centrale nel bilanciare attivazione e soppressione immunitaria. Studi di editing genico e di perturbazione mirati a PDCD1 consentono di analizzare in modo meccanicistico la segnalazione dei checkpoint, le decisioni di destino delle cellule immunitarie e le reti inibitorie dipendenti dal ligando in linfociti umani primari e in modelli in vitro ingegnerizzati.

Le particelle di attivazione lentivirale Pdcd-1 (h2) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di PDCD1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale Pdcd-1 (h2) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione PDCD1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di Pdcd-1. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo PDCD1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.