PCTAIRE-3 Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-422147-LAC

Cdk18 codifica la chinasi serina/treonina PCTAIRE-3 (CDK18), un membro della famiglia delle chinasi ciclina-dipendenti implicato nella regolazione di programmi di fosforilazione associati al ciclo cellulare e della dinamica del citoscheletro. Nelle cellule murine, PCTAIRE-3 è stata collegata al controllo del turnover proteico e della segnalazione responsiva allo stress, con connessioni riportate a vie che regolano le risposte al danno al DNA e la sopravvivenza cellulare in condizioni di stress proteotossico. L’alterazione della segnalazione della famiglia CDK è ampiamente rilevante per fenotipi proliferativi e per il mantenimento del genoma, rendendo Cdk18 un nodo utile per analizzare reti regolatorie guidate da chinasi. Lo studio dell’attività endogena di PCTAIRE-3 può supportare lavori meccanicistici sul controllo del ciclo cellulare, sulla biologia delle chinasi associate a neuroni o cellule germinali e sulla mappatura di vie in modelli rilevanti per la malattia, senza implicare un beneficio clinico.

Le particelle di attivazione lentivirale PCTAIRE-3 (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Cdk18 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale PCTAIRE-3 (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Cdk18, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di PCTAIRE-3. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Cdk18 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.