Parkin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400226-ACT

Il gene umano **PARK2** codifica Parkin, una ligasi E3 dell’ubiquitina di tipo RBR che marca proteine e organelli danneggiati per la rimozione mediata dal proteasoma dipendente dall’ubiquitina e dall’autofagia. Parkin è un effettore centrale della mitofagia PINK1–Parkin, regolando il controllo qualità mitocondriale, le risposte allo stress ossidativo e l’omeostasi energetica attraverso l’ubiquitinazione coordinata di substrati della membrana mitocondriale esterna. Modulando il turnover proteico e la dinamica degli organelli, Parkin influenza il mantenimento neuronale e programmi più ampi di adattamento cellulare allo stress. La disregolazione dell’ubiquitinazione e della mitofagia legate a PARK2 è stata associata a neurodegenerazione e a un’alterata segnalazione mitocondriale, a supporto del suo frequente impiego in studi meccanicistici della disfunzione mitocondriale.

Parkin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PARK2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Parkin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PARK2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PARK2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Parkin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PARK2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Parkin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Parkin nelle cellule tumorali con espressione di PARK2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.