Pannexin-1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-424967-ACT

Il gene Panx1 del topo codifica la pannessina-1, un canale di membrana plasmatica a grande poro che media il rilascio di ATP e la segnalazione purinergica per coordinare la comunicazione intercellulare. L’attività della pannessina-1 influenza i flussi di Ca2+, le risposte legate all’inflammasoma e la modulazione della segnalazione dell’immunità innata, spesso intersecandosi con le vie recettoriali P2X/P2Y e con i meccanismi di gating dei canali pannessina. In diversi tipi cellulari, PANX1 contribuisce alla regolazione dei segnali “find-me” associati all’apoptosi, delle risposte meccanosensibili e del rilascio di mediatori infiammatori. Una segnalazione PANX1 disregolata è stata collegata in letteratura a neuroinfiammazione, risposte a danno ischemico e alterazioni della segnalazione nel microambiente tumorale–immunitario, a supporto del suo studio in modelli rilevanti per la malattia senza implicare un’utilità clinica.

Pannexin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Panx1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Pannexin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Panx1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Panx1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Pannexin-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Panx1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Pannexin-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Pannexin-1 nelle cellule tumorali con espressione di Panx1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.