p70 S6 kinase/S6K1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400162-ACT

RPS6KB1 codifica la p70 S6 chinasi (S6K1), una chinasi serina/treonina che agisce a valle della segnalazione PI3K–AKT–mTOR per regolare la sintesi proteica, la crescita cellulare e l’omeostasi metabolica. S6K1 fosforila la proteina ribosomiale S6 e altri substrati che coordinano la traduzione dell’mRNA, la biogenesi dei ribosomi e il controllo a feedback della segnalazione dell’insulina e dei fattori di crescita. Integrando segnali nutritivi e mitogeni, RPS6KB1 contribuisce alla progressione del ciclo cellulare, alla sopravvivenza e a programmi di traduzione adattativi allo stress. L’attività mTOR–S6K1 deregolata è spesso studiata in contesti di segnalazione oncogenica, disturbi metabolici e rimodellamento delle vie di crescita associato alla resistenza.

p70 S6 kinase/S6K1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RPS6KB1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

p70 S6 kinase/S6K1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RPS6KB1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RPS6KB1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di p70 S6 kinase/S6K1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RPS6KB1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da p70 S6 kinase/S6K1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via p70 S6 kinase/S6K1 nelle cellule tumorali con espressione di RPS6KB1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.