OIP5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-409486-ACT

OIP5 (Opa-interacting protein 5) è un regolatore conservato del ciclo cellulare, arricchito nei centromeri e strettamente legato alla segregazione dei cromosomi e alla progressione mitotica. Contribuisce alla funzione di cinetocoro/centromero e supporta il corretto assemblaggio del fuso mitotico, allineando l’attività di OIP5 alle reti centrali di controllo della mitosi che salvaguardano la stabilità genomica. Un’espressione deregolata di OIP5 è stata associata a stati proliferativi ed è spesso studiata nel contesto di aneuploidia, instabilità cromosomica e biologia del cancro. In quanto fattore legato alla proliferazione, OIP5 viene anche utilizzato come punto di accesso molecolare per indagare programmi trascrizionali dipendenti dal ciclo cellulare e la regolazione del checkpoint mitotico nelle cellule umane.

OIP5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di OIP5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

OIP5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus OIP5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione OIP5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di OIP5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus OIP5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da OIP5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via OIP5 nelle cellule tumorali con espressione di OIP5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.