Nup133 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-433405-ACT

Il gene murino Nup133 codifica un componente strutturale fondamentale del complesso del poro nucleare (NPC), appartenente al sottocomplesso Nup107–160, che funge da impalcatura per l’assemblaggio dei pori nucleari e sostiene il trasporto nucleo-citoplasmatico. Contribuendo all’organizzazione dell’architettura dell’NPC, Nup133 influenza il traffico di RNA e proteine, la progressione del ciclo cellulare e la dinamica dell’involucro nucleare, inclusa la sua riassemblaggio dopo la mitosi. Alterazioni nella composizione dell’NPC possono modificare i programmi globali di espressione genica a causa del trasporto compromesso di fattori di trascrizione e della macchina di processamento dell’RNA. In quanto nucleoporina centrale, Nup133 è spesso studiata in contesti che collegano il trasporto nucleare e l’integrità dell’involucro nucleare a fenotipi di sviluppo e a risposte cellulari allo stress.

Nup133 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Nup133 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Nup133 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Nup133 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Nup133, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Nup133. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Nup133 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Nup133 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Nup133 nelle cellule tumorali con espressione di Nup133 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.