NPC2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402010-ACT

Il gene umano **NPC2** codifica una proteina lisosomiale solubile in grado di legare il colesterolo, che coopera con **NPC1** per mobilizzare il colesterolo non esterificato e altri lipidi da endosomi tardivi/lisosomi verso vie di traffico intracellulari a valle. L’attività di NPC2 sostiene l’omeostasi degli steroli, la composizione delle membrane e la segnalazione dipendente dai lipidi regolando l’uscita del colesterolo e la sua distribuzione al reticolo endoplasmatico e alla membrana plasmatica. L’alterazione del trasporto dipendente da NPC2 provoca accumulo lisosomiale di lipidi e compromette la funzione endolisosomiale, collegando NPC2 alla malattia di Niemann-Pick di tipo C2 e, più in generale, a vie implicate nella neurodegenerazione e nella disfunzione metabolica. In quanto componente centrale del traffico intracellulare dei lipidi, NPC2 è spesso studiato nei meccanismi che regolano la dinamica autofagia-lisosoma, il trasporto vescicolare e i programmi di espressione genica regolati dal colesterolo.

NPC2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NPC2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NPC2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NPC2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NPC2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NPC2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NPC2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NPC2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NPC2 nelle cellule tumorali con espressione di NPC2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.