NIS Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402298-ACT

SLC5A5 codifica il simportatore sodio/ioduro (NIS), un trasportatore della membrana plasmatica che accoppia l’ingresso dello ioduro al gradiente elettrochimico del sodio, concentrando lo ioduro all’interno delle cellule. L’attività di NIS sostiene processi biosintetici dipendenti dallo ioduro e influenza l’equilibrio redox cellulare; la sua regolazione è legata allo stato di differenziazione e a programmi di controllo trascrizionale che governano l’espressione dei trasportatori di membrana. Alterazioni dell’espressione di SLC5A5 e la sua mislocalizzazione sono state riportate in contesti tiroidei e non tiroidei, nei quali una gestione compromessa dello ioduro può fungere da indicatore funzionale dell’identità di linea cellulare e del traffico dei trasportatori. Queste caratteristiche rendono NIS un modello utile per studiare la biologia dei solute carrier, la maturazione delle proteine di membrana e i meccanismi trascrizionali che controllano la specializzazione epiteliale.

NIS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC5A5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NIS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC5A5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC5A5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NIS. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC5A5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NIS nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NIS nelle cellule tumorali con espressione di SLC5A5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.