nephrin Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-424905-ACT

Il gene murino Nphs1 codifica la nefrina, una proteina transmembrana della superfamiglia delle immunoglobuline che costituisce il nucleo del diaframma a fessura dei podociti ed è essenziale per l’integrità della barriera di filtrazione glomerulare. La nefrina partecipa a complessi multiproteici con podocina e CD2AP e si collega al rimodellamento del citoscheletro di actina tramite vie di segnalazione che includono PI3K/AKT e le chinasi della famiglia Src, sostenendo la sopravvivenza e l’architettura dei podociti. Alterazioni dell’espressione o della localizzazione della nefrina compromettono la struttura del diaframma a fessura, causando una permeabilità anomala e fenotipi associati a proteinuria, ampiamente studiati in modelli di malattia renale. In quanto marcatore arricchito nei podociti, la regolazione di Nphs1 viene spesso analizzata in studi sullo sviluppo glomerulare, sulle risposte al danno e sul mantenimento della barriera di filtrazione.

nephrin Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Nphs1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

nephrin Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Nphs1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Nphs1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di nephrin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Nphs1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da nephrin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via nephrin nelle cellule tumorali con espressione di Nphs1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.