NEDL2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-435931-ACT

Hecw2 murino codifica NEDL2, una ligasi E3 dell’ubiquitina di tipo HECT che regola il turnover proteico e l’output di segnalazione tramite un controllo dipendente dall’ubiquitina della stabilità e della localizzazione dei substrati. L’attività di NEDL2 contribuisce alla proteostasi e può influenzare vie che regolano lo sviluppo neuronale, la funzione sinaptica e la trascrizione responsiva allo stress, modulando l’ubiquitinazione di proteine regolatorie chiave. In virtù del suo ruolo nella regolazione mediata dall’ubiquitina, Hecw2 viene studiato nel contesto di fenotipi neuroevolutivi e neurocomportamentali e di meccanismi più ampi di deregolazione della segnalazione ubiquitinica. Ciò rende Hecw2 un bersaglio utile per analizzare come le ligasi E3 modulino le transizioni di stato cellulare e la segnalazione a livello di rete in modelli cellulari murini.

NEDL2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Hecw2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NEDL2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Hecw2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Hecw2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NEDL2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Hecw2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NEDL2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NEDL2 nelle cellule tumorali con espressione di Hecw2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.