NCOAT Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402329-ACT

MGEA5 codifica NCOAT (nota anche come O-GlcNAcase, OGA), un enzima bifunzionale che rimuove le modifiche O-GlcNAc dai residui di serina/treonina delle proteine nucleari e citoplasmatiche, controbilanciando la O-GlcNAc transferasi per regolare il ciclo dinamico dell’O-GlcNAc. Modulando l’O-GlcNAcilazione, NCOAT influenza il controllo trascrizionale, l’organizzazione della cromatina, la proteostasi e la trasduzione del segnale in vie responsabili ai nutrienti e allo stress. Alterazioni dell’omeostasi dell’O-GlcNAc sono state associate a una deregolazione della segnalazione metabolica, del controllo del ciclo cellulare e di processi neurodegenerativi, rendendo MGEA5 un nodo rilevante per studi meccanicistici sull’adattamento cellulare. Nelle cellule umane, la perturbazione dell’attività di NCOAT può rimodellare le reti di modificazione proteica che intersecano la segnalazione insulinica e i programmi di risposta allo stress.

NCOAT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MGEA5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NCOAT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MGEA5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MGEA5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NCOAT. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MGEA5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NCOAT nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NCOAT nelle cellule tumorali con espressione di MGEA5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.