MTMR5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-410999-ACT

SBF1 codifica MTMR5, una pseudofosfatasi inattiva dal punto di vista catalitico, correlata alle miotubularine, che funge da impalcatura (scaffold) nella segnalazione dei fosfoinositidi e nel traffico di membrana endosomiale. MTMR5 interagisce con miotubularine attive come MTMR2 per regolare l’omeostasi del fosfatidilinositolo 3-fosfato e del fosfatidilinositolo 3,5-bisfosfato, influenzando la dinamica endosoma–lisosoma, il turnover dei recettori e l’organizzazione del citoscheletro. Attraverso questi processi, SBF1 è stato collegato a vie che governano la mielinizzazione, il mantenimento assonale e le risposte allo stress cellulare. Le variazioni genetiche e l’espressione deregolata in questo asse sono associate a fenotipi di neuropatia ereditaria e a contesti più ampi di neuro-sviluppo e biologia tumorale, in cui risulta alterata la segnalazione dipendente dal traffico intracellulare.

MTMR5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SBF1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MTMR5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SBF1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SBF1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MTMR5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SBF1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MTMR5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MTMR5 nelle cellule tumorali con espressione di SBF1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.