MTHFD1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403353-ACT

L’MTHFD1 umano codifica un enzima citosolico trifunzionale dipendente dai folati che catalizza l’interconversione tra 10-formil-, 5,10-metenil- e 5,10-metilen-tetraidrofolato, fornendo unità a un atomo di carbonio necessarie per la biosintesi de novo di purine e timidilato e per le reazioni di metilazione. Accoppiando il metabolismo dei folati alla produzione di nucleotidi, MTHFD1 sostiene la replicazione e la riparazione del DNA e la progressione del ciclo cellulare, soprattutto in condizioni di elevata richiesta proliferativa. La deregolazione del metabolismo a un carbonio è stata collegata a instabilità genomica e ad alterazioni degli stati epigenetici, rendendo MTHFD1 un nodo frequentemente studiato nel rimodellamento metabolico e nell’adattamento allo stress. La variabilità genetica o un’espressione alterata di MTHFD1 è inoltre associata a fenotipi correlati ai folati e alla suscettibilità a disturbi che coinvolgono uno squilibrio dei nucleotidi e una ridotta disponibilità di donatori di gruppi metilici.

MTHFD1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MTHFD1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MTHFD1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MTHFD1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MTHFD1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MTHFD1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MTHFD1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MTHFD1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MTHFD1 nelle cellule tumorali con espressione di MTHFD1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.