MRP2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400601-ACT

ABCC2 codifica la multidrug resistance–associated protein 2 (MRP2), un trasportatore di efflusso della famiglia ATP-binding cassette, localizzato principalmente sulla membrana apicale delle cellule epiteliali polarizzate come epatociti, enterociti e cellule del tubulo prossimale renale. MRP2 esporta un’ampia gamma di anioni endogeni e xenobiotici, inclusi coniugati del glutatione, del glucuronide e del solfato, supportando la detossificazione di fase II e la formazione della bile all’interno delle vie di trasporto epatobiliari. Controllando l’efflusso cellulare dei metaboliti coniugati, MRP2 contribuisce alla gestione dello stress ossidativo e all’omeostasi chimica nei tessuti di barriera. Alterazioni dell’espressione o della funzione di ABCC2 sono state associate a fenotipi di escrezione biliare compromessa e a variabilità nella disposizione dei composti coniugati, rendendolo un bersaglio rilevante per studi meccanicistici nella biologia epatica ed epiteliale.

MRP2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ABCC2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MRP2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ABCC2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ABCC2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MRP2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ABCC2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MRP2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MRP2 nelle cellule tumorali con espressione di ABCC2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.