ME2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402900-ACT

ME2 umano codifica l’enzima malico mitocondriale NAD-dipendente, che catalizza la decarbossilazione ossidativa del malato a piruvato, collegando il ciclo dell’acido tricarbossilico con l’equilibrio redox mitocondriale e con il flusso anaplerotico/cataplerotico. Produciendo NADH e regolando la disponibilità di piruvato, ME2 sostiene il metabolismo ossidativo, l’omeostasi delle specie reattive dell’ossigeno e i programmi biosintetici associati a stati proliferativi. Alterazioni dell’attività di ME2 sono state associate alla riprogrammazione metabolica e a fenotipi di disfunzione mitocondriale osservati nella biologia del cancro e nella ricerca sulla neurodegenerazione, dove variazioni nell’interconversione malato–piruvato influenzano vincoli energetici e redox. ME2 è quindi ampiamente studiato nei pathway che regolano il metabolismo mitocondriale, la segnalazione redox e le risposte allo stress.

ME2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ME2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ME2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ME2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ME2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ME2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ME2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ME2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ME2 nelle cellule tumorali con espressione di ME2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.