MARCKS Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400837-ACT

Il substrato della chinasi C ricco di alanina miristoilato (MARCKS) è un importante substrato di PKC che si associa alla membrana plasmatica e al citoscheletro di actina per regolare la forma cellulare, l’adesione e la motilità. Legandosi al fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PIP2) e reticolando la F-actina, MARCKS influenza il traffico di membrana, l’esocitosi/endocitosi e la trasduzione del segnale a valle di PKC e di Ca2+/calmodulina. Il rimodellamento del citoscheletro dipendente da MARCKS è implicato nella crescita dei neuriti e nella plasticità sinaptica, così come nella migrazione delle cellule immunitarie e nella segnalazione infiammatoria. Un’espressione o una fosforilazione deregolata di MARCKS è stata riportata in contesti di biologia del cancro, neuroinfiammazione e patologie polmonari, a supporto del suo impiego come nodo meccanicistico negli studi su migrazione, invasione e segnalazione dipendente dallo stimolo.

MARCKS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MARCKS senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MARCKS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MARCKS nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MARCKS, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MARCKS. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MARCKS nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MARCKS nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MARCKS nelle cellule tumorali con espressione di MARCKS silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.