MARCH5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404655-ACT

MARCH5 (noto anche come MITOL) codifica una ligasi E3 dell’ubiquitina di tipo RING localizzata sulla membrana esterna mitocondriale, che regola l’ubiquitinazione e il turnover delle proteine per mantenere l’omeostasi mitocondriale. Coordinando dinamiche mitocondriali, controllo qualità e segnalazione, MARCH5 influenza l’equilibrio tra fissione e fusione e partecipa a vie di risposta allo stress che intersecano mitofagia e apoptosi. Modula la stabilità di proteine mitocondriali chiave coinvolte nella morfologia dell’organello e nella proteostasi, contribuendo così a plasmare le risposte cellulari allo stress ossidativo e proteotossico. Un’attività disregolata di MARCH5 è stata associata a un’alterata funzione mitocondriale osservata in biologia del cancro e in fenotipi cellulari legati alla neurodegenerazione, rendendolo un bersaglio utile per studi meccanicistici delle reti di segnalazione mitocondriale.

MARCH5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MARCH5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MARCH5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MARCH5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MARCH5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MARCH5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MARCH5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MARCH5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MARCH5 nelle cellule tumorali con espressione di MARCH5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.