KIR4.1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402244-ACT

KCNJ10 codifica per il canale del potassio a rettificazione interna KIR4.1, un determinante chiave del potenziale di membrana e del buffering del potassio in contesti gliali ed epiteliali. Nel sistema nervoso centrale, KIR4.1 favorisce la rimozione del K+ extracellulare e il buffering spaziale, processi collegati all’eccitabilità neuronale, all’omeostasi degli astrociti e ai meccanismi di accoppiamento ione/acqua. L’attività del canale si integra con il mantenimento dei gradienti elettrochimici e influenza la segnalazione a valle attraverso variazioni del potenziale di riposo e dell’eccitabilità cellulare. Alterazioni genetiche e funzionali di KCNJ10 sono state associate a fenotipi di neurosviluppo e a manifestazioni legate alle crisi epilettiche, a sostegno della sua rilevanza negli studi sulla disfunzione dei canali ionici e sulla biologia della glia.

KIR4.1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KCNJ10 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

KIR4.1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KCNJ10 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KCNJ10, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di KIR4.1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KCNJ10 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da KIR4.1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via KIR4.1 nelle cellule tumorali con espressione di KCNJ10 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.