KCC1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405294-ACT

SLC12A4 umano codifica il cotrasportatore K+-Cl− KCC1, un trasportatore di membrana elettroneutro che media l’efflusso accoppiato di potassio e cloruro per regolare la concentrazione intracellulare di cloruro, il volume cellulare e l’omeostasi osmotica. L’attività di KCC1 influenza i gradienti elettrochimici che determinano il potenziale di membrana e la segnalazione dipendente dal cloruro, interfacciandosi con reti di trasporto ionico controllate dalle vie chinasiche WNK-SPAK/OSR1 e dalle risposte regolata dal volume. Grazie al suo ruolo nel mantenimento dell’equilibrio ionico, KCC1 contribuisce a processi quali la proliferazione, la sensibilità all’apoptosi e lo stato di idratazione cellulare in molteplici tessuti. Un trasporto catione-cloruro deregolato è stato implicato in stati patologici in cui risultano alterati il controllo del volume e la gestione del cloruro, supportando l’uso di SLC12A4 come nodo meccanicistico negli studi di biologia dei trasportatori e di adattamento allo stress.

KCC1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC12A4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

KCC1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC12A4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC12A4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di KCC1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC12A4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da KCC1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via KCC1 nelle cellule tumorali con espressione di SLC12A4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.