KA2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405272-ACT

GRIK5 codifica la subunità KA2 del recettore kainato, un partner obbligato che si assembla con altre subunità dei recettori kainato per formare recettori ionotropi del glutammato funzionali nelle sinapsi eccitatorie. I recettori contenenti KA2 contribuiscono alla rapida trasmissione sinaptica e alla plasticità dipendente dall’attività regolando il flusso di cationi e modulando l’eccitabilità neuronale, collegando GRIK5 alle reti di segnalazione glutammatergica e alle vie a valle dipendenti dal calcio. Attraverso effetti sull’integrazione sinaptica e sull’equilibrio eccitazione/inibizione a livello di circuito, l’alterata espressione di KA2 o la composizione dei recettori è stata studiata nel contesto di fenotipi neuroevolutivi e neuropsichiatrici, nonché della suscettibilità alle crisi epilettiche. Queste proprietà rendono GRIK5 un nodo utile per indagare l’assemblaggio e il traffico dei recettori sinaptici e la neurotrasmissione eccitatoria in modelli cellulari umani.

KA2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GRIK5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

KA2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GRIK5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GRIK5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di KA2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GRIK5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da KA2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via KA2 nelle cellule tumorali con espressione di GRIK5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.