IRP-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401817-ACT

L’ACO1 umano codifica la proteina regolatrice del ferro 1 (IRP-1), un fattore citosolico bifunzionale che può interconvertirsi tra una forma di aconitasi enzimaticamente attiva e un regolatore legante l’RNA a seconda dello stato del suo cluster [4Fe-4S]. In qualità di IRP-1, si lega agli elementi responsivi al ferro (IRE) negli mRNA bersaglio per coordinare l’assorbimento, lo stoccaggio e l’utilizzo del ferro modulando la traduzione e la stabilità degli mRNA, integrando la biogenesi dei cluster ferro-zolfo con i programmi redox e metabolici cellulari. Attraverso questa rete di controllo post-trascrizionale, ACO1 contribuisce a mantenere l’omeostasi del ferro e influenza vie legate alla funzione mitocondriale, alle risposte allo stress ossidativo e all’assemblaggio dell’eme e delle proteine ferro-zolfo. La deregolazione del segnale IRP-1/IRE e le alterazioni dell’attività di ACO1 sono spesso studiate in contesti di sovraccarico o carenza di ferro, nella biologia correlata all’anemia e nel rimodellamento metabolico associato a neurodegenerazione e cancro.

IRP-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ACO1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

IRP-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ACO1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ACO1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di IRP-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ACO1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da IRP-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via IRP-1 nelle cellule tumorali con espressione di ACO1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.