HVEM Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402104-ACT

TNFRSF14 codifica HVEM (herpesvirus entry mediator), un membro della superfamiglia dei recettori del TNF che integra segnali immunitari stimolatori e inibitori sulla superficie cellulare. HVEM interagisce con molteplici ligandi, tra cui LIGHT (TNFSF14), BTLA e CD160, per modulare programmi trascrizionali associati a NF-κB e MAPK che determinano l’attivazione delle cellule T, la produzione di citochine e l’omeostasi immunitaria. Attraverso il crosstalk con le vie costimolatorie e di checkpoint, HVEM contribuisce alla regolazione del traffico linfocitario e delle risposte infiammatorie in diversi contesti tissutali. Una segnalazione di HVEM deregolata è stata implicata nell’infiammazione immunomediata e nelle interazioni tra tumore e sistema immunitario, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici dell’immunoregolazione e della segnalazione del microambiente.

HVEM Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TNFRSF14 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HVEM Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TNFRSF14 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TNFRSF14, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HVEM. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TNFRSF14 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HVEM nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HVEM nelle cellule tumorali con espressione di TNFRSF14 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.