HIF PHD2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403334-ACT

EGLN1 codifica per HIF PHD2, una prolil-idrossilasi dipendente da 2-ossoglutarato/Fe(II) che, in condizioni di normossia, idrossila le subunità HIF-α, consentendone il riconoscimento da parte di von Hippel–Lindau (VHL) e la successiva degradazione tramite il proteasoma. Attraverso questa via di sensing dell’ossigeno, HIF PHD2 modula programmi trascrizionali che controllano angiogenesi, eritropoiesi, metabolismo glicolitico, adattamento mitocondriale e sopravvivenza cellulare durante lo stress ipossico. Alterazioni dell’attività di EGLN1/PHD2 influenzano l’intensità della segnalazione HIF e sono state associate a fenotipi di adattamento all’ipossia e a patologie caratterizzate da un’omeostasi dell’ossigeno deregolata, inclusi aspetti della biologia tumorale, il rimodellamento vascolare polmonare e meccanismi legati all’eritrocitosi. In quanto nodo centrale nel sensing cellulare dell’ossigeno, EGLN1 è ampiamente studiato per i suoi effetti sulle reti geniche inducibili dall’ipossia e sulla riprogrammazione metabolica.

HIF PHD2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EGLN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HIF PHD2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EGLN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EGLN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HIF PHD2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EGLN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HIF PHD2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HIF PHD2 nelle cellule tumorali con espressione di EGLN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.