G_{α s} Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400476-ACT

GNAS codifica la subunità alfa della proteina G stimolatoria, Gα s, un mediatore centrale della segnalazione dei GPCR che attiva l’adenilil ciclasi aumentando i livelli intracellulari di cAMP e attivando programmi trascrizionali dipendenti da PKA e CREB. Attraverso queste vie, Gα s regola la risposta ormonale, il controllo metabolico e la differenziazione in numerosi tessuti, integrando segnali provenienti dai recettori per le catecolamine, il glucagone e molti ormoni peptidici. GNAS è inoltre soggetto a un complesso imprinting genomico che può determinare effetti di dosaggio specifici per tessuto e squilibri di segnalazione. Una segnalazione GNAS/Gα s deregolata è associata a disturbi endocrini e scheletrici ed è stata implicata nell’attivazione oncogenica della via del cAMP in diversi contesti tumorali.

Gα s Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GNAS senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Gα s Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GNAS nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GNAS, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Gα s. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GNAS nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Gα s nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Gα s nelle cellule tumorali con espressione di GNAS silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.