GRIP-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401800-ACT

NCOA2 codifica per GRIP-1 (glucocorticoid receptor-interacting protein 1), un coattivatore dei recettori nucleari che funge da impalcatura per i complessi trascrizionali e coordina il rimodellamento della cromatina per regolare l’espressione genica in risposta agli ormoni. GRIP-1 integra i segnali provenienti dai recettori steroidei e da altri recettori nucleari con programmi trascrizionali che controllano proliferazione, differenziamento, metabolismo e risposte infiammatorie. Opera all’interno di assemblaggi di coattivatori che collegano il legame del recettore al reclutamento di istone acetiltransferasi e di componenti del mediatore, modulando l’attività di promotori ed enhancer. La disregolazione della trascrizione dipendente da NCOA2 è stata associata ad alterazioni della segnalazione endocrina ed è implicata in contesti di riprogrammazione trascrizionale oncogena e di patologie dello sviluppo.

GRIP-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NCOA2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GRIP-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NCOA2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NCOA2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GRIP-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NCOA2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GRIP-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GRIP-1 nelle cellule tumorali con espressione di NCOA2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.