GRAMD1B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-408929-ACT

Il gene umano **GRAMD1B** codifica una proteina associata alla membrana contenente un dominio GRAM, implicata nel trasporto intracellulare degli steroli e nell’organizzazione dei siti di contatto tra reticolo endoplasmatico e membrana plasmatica. Attraverso il rilevamento dei lipidi mediato dal dominio GRAM e il reclutamento in compartimenti di membrana specifici, GRAMD1B è collegato all’omeostasi del colesterolo, alla composizione delle membrane e a processi di segnalazione dipendenti dai lipidi che influenzano il traffico vescicolare e le risposte cellulari allo stress. Un’espressione alterata di GRAMD1B è stata riportata in studi genomici e trascrittomici in molteplici contesti patologici, inclusi il cancro e condizioni immuno-correlate, a supporto del suo impiego in studi meccanicistici delle vie accoppiate al metabolismo lipidico. L’analisi funzionale di GRAMD1B contribuisce a chiarire come la distribuzione degli steroli e la dinamica dei contatti di membrana modulino la regolazione dello stato cellulare e gli output delle reti di segnalazione.

GRAMD1B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GRAMD1B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GRAMD1B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GRAMD1B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GRAMD1B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GRAMD1B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GRAMD1B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GRAMD1B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GRAMD1B nelle cellule tumorali con espressione di GRAMD1B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.