GPR34 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423884-ACT

Il gene murino Gpr34 codifica GPR34, un recettore accoppiato a proteine G (GPCR) di classe A, di tipo rodopsina, arricchito nelle linee immunitarie e mieloidi, incluse le microglia. La segnalazione mediata da GPR34 è stata collegata alla modulazione della chemiotassi, del tono infiammatorio e delle vie dei GPCR dipendenti dall’AMPc che plasmano l’attivazione dell’immunità innata e il comportamento dei macrofagi residenti nei tessuti. Nel sistema nervoso centrale, GPR34 contribuisce all’omeostasi delle microglia e alle risposte a segnali associati al danno, intersecandosi con processi neuroinfiammatori. Alterazioni della segnalazione GPCR attraverso GPR34 sono state studiate in contesti di patologie infiammatorie e nella biologia mieloide associata ai tumori, a supporto del suo impiego come sonda per indagare i meccanismi di regolazione immunitaria.

GPR34 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Gpr34 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GPR34 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Gpr34 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Gpr34, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GPR34. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Gpr34 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GPR34 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GPR34 nelle cellule tumorali con espressione di Gpr34 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.