GnT-IVA Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-407146-ACT

MGAT4A umano codifica la N-acetilglucosaminiltransferasi IVa (GnT-IVA), una glicosiltransferasi residente nel Golgi che aggiunge ramificazioni di N-acetilglucosamina legate in β1,4 ai N-glicani complessi. Questo passaggio enzimatico contribuisce alla ramificazione dei N-glicani, che può modulare il ripiegamento e il traffico delle proteine, la permanenza dei recettori sulla superficie cellulare e la dinamica della segnalazione a valle. La glicosilazione dipendente da MGAT4A si integra con reti più ampie di biosintesi dei glicani che influenzano le interazioni cellula–cellula, il sensing dei nutrienti e la regolazione dei recettori di membrana. La N-glicosilazione deregolata e i pattern di ramificazione alterati che coinvolgono MGAT4A sono stati studiati in contesti di disfunzione metabolica e di glicofenotipi associati al cancro, supportandone l’impiego nella ricerca sui meccanismi di via e nella scoperta di biomarcatori.

GnT-IVA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MGAT4A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GnT-IVA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MGAT4A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MGAT4A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GnT-IVA. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MGAT4A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GnT-IVA nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GnT-IVA nelle cellule tumorali con espressione di MGAT4A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.