GHRH Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404753-ACT

Il GHRH umano codifica per l’ormone di rilascio dell’ormone della crescita, un peptide ipotalamico che stimola i somatotrofi dell’adenoipofisi a secernere l’ormone della crescita tramite l’interazione con il recettore GHRHR e la conseguente segnalazione a valle cAMP/PKA. Attraverso la regolazione dell’asse GH–IGF, il GHRH contribuisce alla crescita sistemica, all’omeostasi metabolica e al controllo neuroendocrino del bilancio energetico. Un’alterazione della segnalazione del GHRH è stata associata a una funzione ipofisaria disregolata e a fenotipi di crescita anomali, ed è spesso oggetto di studio nella ricerca sulle malattie endocrine e metaboliche. Oltre ai ruoli neuroendocrini centrali, l’attività della via del GHRH viene studiata per i suoi effetti sui programmi di proliferazione e sopravvivenza cellulare in modelli cellulari pertinenti.

GHRH Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GHRH senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GHRH Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GHRH nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GHRH, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GHRH. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GHRH nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GHRH nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GHRH nelle cellule tumorali con espressione di GHRH silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.