GC-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403599-ACT

OLFM4 (olfactomedina 4), noto anche come GC-1, codifica una glicoproteina secreta arricchita nell’epitelio gastrointestinale e nei compartimenti ematopoietici, dove rappresenta un marcatore di sottopopolazioni di cellule staminali e progenitrici. OLFM4 contribuisce all’omeostasi epiteliale modulando l’adesione cellulare, la differenziazione e la segnalazione dell’immunità innata, con legami funzionali a programmi associati a Wnt/β-catenina e a vie infiammatorie nella nicchia intestinale. Un’espressione alterata di OLFM4 è stata riportata in diverse condizioni infiammatorie intestinali e in molte neoplasie, dove viene spesso studiato come regolatore dipendente dal contesto di proliferazione, sopravvivenza e rimodellamento tissutale. Nei sistemi umani, OLFM4 è ampiamente utilizzato per stratificare gli stati cellulari e per indagare i meccanismi che governano la funzione di barriera e i fenotipi associati ai tumori.

GC-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di OLFM4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GC-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus OLFM4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione OLFM4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GC-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus OLFM4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GC-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GC-1 nelle cellule tumorali con espressione di OLFM4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.