G2A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401866-ACT

GPR132 codifica G2A, un recettore accoppiato a proteine G (GPCR) implicato nel rilevamento di mediatori lipidici extracellulari e di segnali del microambiente che modulano le risposte immunitarie e allo stress. La segnalazione di G2A è stata collegata alla regolazione della chemiotassi dei leucociti, dell’attivazione dei macrofagi e del tono infiammatorio attraverso vie di secondi messaggeri dipendenti dai GPCR, influenzando programmi di sopravvivenza cellulare e di differenziamento. Nei tessuti umani, un’alterata attività di GPR132 è associata a infiammazione deregolata e a processi di rimodellamento che si intrecciano con le interazioni tumore–sistema immunitario e con la biologia dello stress metabolico. In quanto recettore di membrana con output di segnalazione dipendenti dal contesto, G2A è spesso studiato per capire come il sensing dei lipidi si integri con il traffico delle cellule immunitarie e con l’omeostasi tissutale.

G2A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GPR132 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

G2A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GPR132 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GPR132, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di G2A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GPR132 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da G2A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via G2A nelle cellule tumorali con espressione di GPR132 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.