FXYD3 Plasmide di attivazione CRISPR (h2): sc-406431-ACT-2

Il gene umano FXYD3 codifica un piccolo regolatore di membrana a singolo passaggio della Na⁺/K⁺-ATPasi, modulandone la cinetica della pompa e influenzando così l’omeostasi ionica cellulare, il potenziale di membrana e la regolazione del volume in contesti epiteliali. Attraverso il controllo del trasporto di sodio e potassio, FXYD3 incide su processi a valle legati a proliferazione, differenziamento e adattamento allo stress, che si intrecciano con reti di segnalazione sensibili all’equilibrio ionico. Un’alterazione dell’espressione di FXYD3 è stata riportata in molteplici carcinomi e in altre patologie epiteliali, a sostegno della sua rilevanza per studi sulla biologia del trasporto deregolata e sui cambiamenti metabolici e del microambiente associati ai tumori. L’editing genetico o la perturbazione di FXYD3 consente indagini meccanicistiche sulla regolazione della Na⁺/K⁺-ATPasi, sulla proteostasi di membrana e su fenotipi dipendenti dagli ioni in modelli cellulari umani, incluse analisi funzionali dell’attività della pompa, della migrazione e delle proprietà di barriera dell’epitelio.

FXYD3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FXYD3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FXYD3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FXYD3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FXYD3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FXYD3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FXYD3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FXYD3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FXYD3 nelle cellule tumorali con espressione di FXYD3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.