FRY Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404629-ACT

FRY umano codifica una grande proteina associata ai microtubuli, evolutivamente conservata, implicata nell’organizzazione del citoscheletro, nella polarità cellulare e nel controllo della proliferazione. FRY è stato collegato alla segnalazione correlata alla via Hippo e a reti di chinasi che accoppiano la dinamica di centrosoma e microtubuli alla progressione del ciclo cellulare e alla morfogenesi. Attraverso questi processi, FRY viene studiato in contesti quali l’organizzazione epiteliale, lo sviluppo neuronale e la migrazione, in cui alterazioni della regolazione del citoscheletro possono influenzare fenotipi oncogenici. Un’espressione o una funzione di FRY alterata è stata riportata in molteplici dataset rilevanti per la malattia, supportandone l’impiego come bersaglio di ricerca per analizzare le vie che governano il controllo della crescita e l’architettura tissutale.

FRY Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FRY senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FRY Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FRY nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FRY, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FRY. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FRY nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FRY nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FRY nelle cellule tumorali con espressione di FRY silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.