Fibronectin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400082-ACT

FN1 codifica la fibronectina, una glicoproteina principale della matrice extracellulare che coordina l’adesione e la migrazione cellulare e il rimodellamento tissutale attraverso il legame con integrine, collagene e proteoglicani eparan-solfato. La fibronectina partecipa alle adesioni focali e alla segnalazione di meccanotrasduzione, coordinando la dinamica del citoscheletro di actina e regolando vie come FAK/SRC, la segnalazione delle GTPasi Rho e l’organizzazione della matrice extracellulare guidata da TGF-β. Nella biologia umana, un’espressione o una deposizione alterata di FN1 è associata a una riparazione delle ferite disfunzionale, fibrosi, invasione delle cellule tumorali e rimodellamento del microambiente stromale. Queste proprietà rendono FN1 un bersaglio centrale per lo studio dell’assemblaggio della matrice extracellulare, della plasticità epitelio-mesenchimale e delle reti di segnalazione dipendenti dalle integrine.

Fibronectin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Fibronectin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Fibronectin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Fibronectin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Fibronectin nelle cellule tumorali con espressione di FN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.