FANCM Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403495-ACT

FANCM umano codifica una traslocasi del DNA che opera nella via dell’anemia di Fanconi (FA) per mantenere la stabilità del genoma durante lo stress replicativo. FANCM riconosce le forcelle di replicazione bloccate e i crosslink interfilamento, coordinandosi con il complesso core FA, la segnalazione del checkpoint dipendente da ATR e i fattori della ricombinazione omologa per promuovere il rimodellamento e la riparazione della forcella. Attraverso i suoi ruoli nell’attraversamento della forcella di replicazione, nel riavvio e nella soppressione della ricombinazione aberrante, FANCM contribuisce a limitare la rottura dei cromosomi e la mutagenesi. L’alterazione della riparazione mediata da FANCM è associata a una ridotta capacità di riparare i crosslink e a fenotipi di instabilità genomica rilevanti per la biologia dell’anemia di Fanconi e per le alterazioni della risposta al danno al DNA associate al cancro.

FANCM Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FANCM senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FANCM Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FANCM nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FANCM, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FANCM. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FANCM nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FANCM nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FANCM nelle cellule tumorali con espressione di FANCM silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.