FANCD2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400445-ACT

FANCD2 kodiert einen zentralen Effektor des Fanconi-Anämie-(FA)-Reparaturwegs für DNA-Interstrangvernetzungen, der während der DNA-Replikation die Genomstabilität schützt. Nach Replikationsstress oder Vernetzungsschäden wird FANCD2 monoubiquitinyliert und arbeitet mit FANCI zusammen, um die nukleolytische Prozessierung, die Translesionssynthese und die homologe Rekombination zu koordinieren, wodurch der FA-Core-Komplex mit BRCA-assoziierten Reparaturnetzwerken verknüpft wird. Diese Aktivität ist eng an die S-Phasen-Checkpoint-Signalisierung und den Schutz der Replikationsgabel gekoppelt und trägt dazu bei, Chromosomenbrüche und aberrante Rekombination zu begrenzen. Eine Fehlregulation oder vererbte Defekte der FANCD2-Funktion stehen im Zusammenhang mit der Biologie der Fanconi-Anämie sowie mit breiteren Mechanismen der DNA-Schadenssensitivität und dem Versagen von Tumorsuppressor-Signalwegen in Forschungskontexten.

FANCD2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FANCD2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FANCD2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FANCD2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FANCD2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FANCD2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FANCD2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FANCD2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FANCD2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FANCD2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.