FANCD2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400445-ACT

FANCD2 codifica un effettore centrale della via di riparazione dei crosslink interfilamento del DNA dell’anemia di Fanconi (FA), che salvaguarda la stabilità del genoma durante la replicazione del DNA. In seguito a stress replicativo o a danni da crosslink, FANCD2 viene monoubiquitinata e coopera con FANCI per coordinare il processamento nucleolitico, la sintesi translesione e la ricombinazione omologa, collegando il complesso core della FA alle reti di riparazione associate a BRCA. Questa attività è strettamente accoppiata alla segnalazione del checkpoint della fase S e alla protezione della forcella di replicazione, contribuendo a limitare le rotture cromosomiche e la ricombinazione aberrante. La disregolazione o difetti ereditari della funzione di FANCD2 sono associati alla biologia dell’anemia di Fanconi e, in ambito di ricerca, a meccanismi più ampi di sensibilità al danno del DNA e di compromissione delle vie di soppressione tumorale.

FANCD2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FANCD2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FANCD2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FANCD2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FANCD2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FANCD2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FANCD2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FANCD2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FANCD2 nelle cellule tumorali con espressione di FANCD2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.