ERGIC-53 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401602-ACT

LMAN1 codifica ERGIC-53, un recettore di carico di tipo lectinico che cicla tra il reticolo endoplasmatico e il compartimento intermedio RE–Golgi per mediare l’esportazione dal RE di specifiche glicoproteine. Attraverso il riconoscimento di N-glicani ad alto contenuto di mannosio e l’interazione con il macchinario COPII, ERGIC-53 contribuisce a coordinare il traffico della via secretoria e il controllo qualità delle proteine di nuova sintesi. LMAN1 partecipa anche all’omeostasi del RE e collega la processazione delle glicoproteine alle dinamiche del trasporto vescicolare. L’alterazione genetica di LMAN1 è stata associata a una carenza combinata dei fattori V e VIII, evidenziandone la rilevanza per la secrezione regolata e la maturazione proteica nelle fasi iniziali della via secretoria.

ERGIC-53 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LMAN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ERGIC-53 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LMAN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LMAN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ERGIC-53. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LMAN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ERGIC-53 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ERGIC-53 nelle cellule tumorali con espressione di LMAN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.