EGFR Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400015-ACT

Il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) è una tirosin-chinasi recettoriale umana che avvia cascate di segnalazione che controllano la proliferazione, la sopravvivenza, la differenziazione e la migrazione cellulare in seguito alla dimerizzazione e all’autofosforilazione indotte dal ligando. EGFR attiva vie fondamentali, tra cui RAS–RAF–MEK–ERK, PI3K–AKT–mTOR, PLCγ–PKC e JAK–STAT, integrando segnali di crescita extracellulari con programmi trascrizionali e metabolici. Un’espressione o una segnalazione di EGFR deregolate sono frequentemente associate ad alterazioni dell’omeostasi epiteliale e a fenotipi oncogenici, rendendolo un nodo centrale nella biologia dei recettori per fattori di crescita. EGFR è inoltre ampiamente utilizzato come recettore modello per studiare il trafficking recettoriale, l’endocitosi, la regolazione tramite feedback e il cross-talk tra vie di segnalazione in sistemi cellulari umani.

EGFR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EGFR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EGFR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EGFR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EGFR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EGFR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EGFR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EGFR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EGFR nelle cellule tumorali con espressione di EGFR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.