Dia 2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403238-ACT

DIAPH2 (Dia 2) codifica una formina correlata alle diaphanous che regola la nucleazione e l’allungamento dei filamenti di actina, contribuendo al rimodellamento del citoscheletro, alla polarità cellulare e alla citochinesi. In qualità di effettore nelle vie di segnalazione collegate alle GTPasi Rho, DIAPH2 supporta processi quali migrazione e adesione cellulare, coordinando la dinamica dell’actina con il traffico di membrana e il crosstalk con i microtubuli. Alterazioni dell’attività e del dosaggio di DIAPH2 sono state investigate in ambiti di biologia riproduttiva e nel comportamento delle cellule tumorali, dove il controllo del citoscheletro influenza la stabilità cromosomica e fenotipi invasivi. Nella ricerca biomedica, DIAPH2 è spesso studiato per collegare la segnalazione Rho–formina a morfogenesi, progressione del ciclo cellulare e meccanotrasduzione.

Dia 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DIAPH2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Dia 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DIAPH2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DIAPH2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Dia 2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DIAPH2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Dia 2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Dia 2 nelle cellule tumorali con espressione di DIAPH2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.