D54 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-407162-ACT

Il gene umano TPD52L2 codifica D54, un membro della famiglia tumor protein D52-like, coinvolta nel traffico vescicolare, nella dinamica delle membrane e nella regolazione dei programmi di proliferazione e sopravvivenza cellulare. D54 è stato associato a processi secretori ed endocitici che possono influenzare il riciclo dei recettori e gli output di segnalazione intracellulare, intersecando vie che coordinano la crescita e le risposte allo stress. Un’alterata espressione di TPD52L2 è stata riportata in molteplici contesti di cancro e di malattie proliferative, a sostegno della sua utilità come strumento molecolare per studiare transizioni disfunzionali dello stato cellulare. Nella ricerca di base, D54 viene utilizzato per indagare i meccanismi del trasporto intracellulare accoppiato alla segnalazione oncogenica e all’adattamento metabolico.

D54 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TPD52L2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

D54 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TPD52L2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TPD52L2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di D54. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TPD52L2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da D54 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via D54 nelle cellule tumorali con espressione di TPD52L2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.