CUL-3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-416925-ACT

Il gene umano CUL3 codifica la cullina-3 (CUL-3), un’impalcatura centrale dei complessi di ligasi E3 dell’ubiquitina CRL3, che mettono in contatto gli adattatori di substrato con dominio BTB con RBX1 per il trasferimento dell’ubiquitina e la degradazione proteasomiale. Attraverso il turnover selettivo di proteine regolatorie, CUL-3 influenza la proteostasi, la progressione del ciclo cellulare, le risposte allo stress ossidativo e l’organizzazione del citoscheletro, includendo vie legate alla segnalazione KEAP1–NRF2. Un’attività CRL3 deregolata può perturbare l’omeostasi redox e il controllo dei checkpoint, rendendo CUL3 un nodo spesso studiato nella biologia del cancro e nei programmi di adattamento allo stress. Alterazioni delle reti di ubiquitinazione dipendenti da CUL3 sono anche utilizzate per modellare meccanismi rilevanti per fenotipi neuroevolutivi e cardiovascolari in sistemi cellulari.

CUL-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CUL3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CUL-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CUL3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CUL3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CUL-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CUL3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CUL-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CUL-3 nelle cellule tumorali con espressione di CUL3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.