connexin 50 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404332-ACT

GJA8 codifica la conexina 50 (Cx50), una proteina delle giunzioni comunicanti (gap junction) che si oligomerizza in connessoni e forma canali intercellulari che consentono lo scambio diretto di ioni e piccoli metaboliti. Nel cristallino oculare, l’accoppiamento mediato da Cx50 contribuisce all’omeostasi di un tessuto avascolare, alla differenziazione delle cellule delle fibre e al mantenimento della trasparenza del cristallino attraverso una segnalazione coordinata e la condivisione metabolica. La conexina 50 partecipa inoltre a processi di comunicazione cellula-cellula che influenzano proliferazione e differenziazione tramite la regolazione giunzionale dei secondi messaggeri intracellulari. Alterazioni dell’espressione di GJA8 o delle proprietà del canale sono state associate a patologie ereditarie del cristallino, tra cui cataratte congenite e microftalmia, rendendolo un bersaglio rilevante per studi meccanicistici sullo sviluppo del cristallino e sulla proteostasi.

connexin 50 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GJA8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

connexin 50 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GJA8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GJA8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di connexin 50. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GJA8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da connexin 50 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via connexin 50 nelle cellule tumorali con espressione di GJA8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.