citrate synthase Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402227-ACT

Il gene umano **CS** codifica la citrato sintasi, l’enzima della matrice mitocondriale che catalizza la condensazione di ossalacetato e acetil‑CoA per formare citrato, avviando il ciclo dell’acido tricarbossilico (TCA). Controllando l’ingresso nel metabolismo ossidativo, la citrato sintasi supporta la produzione di ATP, l’anaplerosi e la disponibilità di citrato per la biosintesi di lipidi e colesterolo attraverso il flusso di carbonio mitocondrio‑citosolico. L’attività di CS è strettamente legata alla biogenesi mitocondriale, all’omeostasi redox e all’adattamento metabolico in condizioni di stress nutrizionale. Alterazioni dell’espressione di CS o della funzione del ciclo TCA mitocondriale sono spesso studiate nel contesto di disfunzioni metaboliche e del rimodellamento bioenergetico associati a neurodegenerazione, fenotipi cardiometabolici e metabolismo tumorale.

citrate synthase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CS senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

citrate synthase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CS nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CS, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di citrate synthase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CS nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da citrate synthase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via citrate synthase nelle cellule tumorali con espressione di CS silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.