CH25H Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419641-ACT

Ch25h codifica la colesterolo 25-idrossilasi (CH25H), un enzima associato al reticolo endoplasmatico che converte il colesterolo in 25-idrossicolesterolo, un ossisterolo bioattivo che modula l’omeostasi degli steroli e la composizione lipidica delle membrane. Attraverso la regolazione della biosintesi del colesterolo guidata da SREBP e di programmi trascrizionali dipendenti da LXR, CH25H influenza il metabolismo lipidico, il traffico vescicolare e la segnalazione infiammatoria. Nelle cellule immunitarie murine, Ch25h è inducibile da stimoli dell’immunità innata e può modellare gli stati di attivazione di macrofagi e microglia alterando le reti di segnalazione mediate dagli ossisteroli. Un’attività di CH25H deregolata e una produzione anomala di 25-idrossicolesterolo sono state associate a risposte infiammatorie aberranti e a vie di stress metabolico, rendendo Ch25h un nodo utile per studiare il crosstalk immunometabolico in modelli rilevanti per la malattia.

CH25H Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ch25h senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CH25H Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ch25h nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ch25h, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CH25H. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ch25h nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CH25H nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CH25H nelle cellule tumorali con espressione di Ch25h silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.