CD3-ε Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400240-ACT

CD3E codifica CD3-ε, un componente essenziale del complesso recettoriale dei linfociti T (TCR)-CD3 che collega il riconoscimento dell’antigene alla segnalazione intracellulare necessaria per lo sviluppo dei timociti e l’attivazione dei linfociti T periferici. Attraverso i motivi di attivazione basati su tirosina degli immunorecettori (ITAM) presenti nelle catene CD3, CD3-ε supporta le cascate chinasiche prossimali che coinvolgono LCK e ZAP70 e propaga vie a valle come NF-κB, NFAT e MAPK, regolando la produzione di citochine, la proliferazione e la differenziazione. Alterazioni dell’espressione di CD3E o dell’assemblaggio del complesso CD3 possono modificare le soglie di segnalazione del TCR, alterare l’omeostasi immunitaria e contribuire a fenotipi di disregolazione immunitaria. In quanto molecola definente la linea nei linfociti T, CD3-ε è ampiamente utilizzata negli studi sull’architettura della segnalazione recettoriale, sugli stati funzionali dei linfociti T e nei modelli di immuno-oncologia in vitro.

CD3-ε Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CD3E senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CD3-ε Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CD3E nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CD3E, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CD3-ε. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CD3E nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CD3-ε nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CD3-ε nelle cellule tumorali con espressione di CD3E silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.