CD223 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421371-ACT

Lag3 codifica CD223, un recettore inibitorio di checkpoint immunitario espresso sui linfociti T attivati, sui linfociti T regolatori, sulle cellule NK e su sottopopolazioni di cellule dendritiche nel topo. L’interazione di CD223 modula l’intensità del segnale del TCR e orienta la differenziazione effettrice attenuando le vie di attivazione prossimali, contribuendo alla tolleranza periferica e al controllo delle risposte infiammatorie. Nei microambienti immunitari con esposizione persistente all’antigene, CD223 è associato a programmi trascrizionali legati alla disfunzione dei linfociti T e a una produzione citochinica alterata. Per il suo ruolo nella segnalazione dei checkpoint e nell’omeostasi immunitaria, Lag3 è spesso studiato in modelli di infiammazione cronica, infezione e immunologia dei tumori per analizzare i meccanismi di regolazione immunitaria.

CD223 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Lag3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CD223 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Lag3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Lag3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CD223. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Lag3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CD223 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CD223 nelle cellule tumorali con espressione di Lag3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.