caspase-8 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400147-ACT

Il gene umano **CASP8** codifica la **caspasi-8**, una proteasi iniziatrice a cisteina che collega l’attivazione dei recettori della morte alle cascate di caspasi a valle e ai programmi regolati di morte cellulare. Agisce a livello del **DISC** per propagare l’apoptosi estrinseca e si interfaccia con il controllo della **necroptosi** attraverso interazioni con **FADD**, **cFLIP**, **RIPK1** e **RIPK3**, modulando le risposte infiammatorie e allo stress. **CASP8** influenza inoltre la segnalazione immunitaria e le decisioni sul destino cellulare a valle delle vie **TNFR** e **Fas**, con effetti dipendenti dal contesto sulla produzione di citochine e sulla sopravvivenza. La deregolazione dell’attività o dell’espressione della caspasi-8 è stata associata a una sensibilità alterata all’apoptosi, a perturbazioni immunitarie e a meccanismi di evasione della morte cellulare rilevanti per il cancro.

caspase-8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CASP8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

caspase-8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CASP8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CASP8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di caspase-8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CASP8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da caspase-8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via caspase-8 nelle cellule tumorali con espressione di CASP8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.