Calponin 1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401397-ACT

CNN1 codifica la calponina 1, una proteina regolatoria legante l’actina, arricchita nel muscolo liscio e in stati simili ai miofibroblasti, dove modula la contrattilità actomiosinica. Legandosi all’actina filamentosa e influenzando l’attività ATPasica della miosina, la calponina 1 contribuisce all’organizzazione del citoscheletro, all’adesione cellulare e alla generazione di forza contrattile all’interno di vie che coordinano la segnalazione RhoA/ROCK e la dinamica delle fibre di stress di actina. Un’alterata espressione di CNN1 è utilizzata come marcatore di differenziazione del muscolo liscio e di switching fenotipico, processi rilevanti per il rimodellamento vascolare e le risposte fibroproliferative. È stata riportata la disregolazione di programmi citoscheletrici associati alla calponina 1 in contesti di rigidità e motilità tissutale anomale, a supporto del suo impiego in studi sulla plasticità cellulare e sulla meccanobiologia.

Calponin 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CNN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Calponin 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CNN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CNN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Calponin 1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CNN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Calponin 1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Calponin 1 nelle cellule tumorali con espressione di CNN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.