BETA 3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402142-ACT

BHLHE22 (noto anche come BETA 3) codifica un fattore di trascrizione della famiglia basic helix-loop-helix implicato nei programmi di differenziazione e maturazione neuronale. Contribuisce a reti trascrizionali che determinano la specificazione del destino cellulare, lo sviluppo dei neuriti e l’espressione di geni sinaptici, integrandosi con i principali segnali di sviluppo e con il controllo genico regolato dalla cromatina. Un’alterata regolazione dei fattori di trascrizione bHLH è associata a fenotipi del neurosviluppo e a una formazione disfunzionale dei circuiti neuronali, rendendo BHLHE22 un nodo utile per studiare la repressione/attivazione trascrizionale dipendente dal contesto. Le applicazioni di ricerca includono comunemente la mappatura dei bersagli a valle, la definizione di elementi regolatori specifici per tipo cellulare e l’analisi di reti di regolazione genica rilevanti per lo sviluppo cerebrale e i meccanismi delle malattie neurologiche.

BETA 3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BHLHE22 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BETA 3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BHLHE22 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BHLHE22, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BETA 3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BHLHE22 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BETA 3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BETA 3 nelle cellule tumorali con espressione di BHLHE22 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.